盘点PCR的七大应用领域

通常可通过PCR来检测不同细胞类型、组织和生物体在特定时间点的基因表达差异。首先，从目标样品中分离出RNA并将mRNA逆转录成cDNA。随后，通过由PCR扩增的cDNA数量，确定mRNA的初始水平。这一过程也被称为逆转录PCR， RT-PCR （图1）。

图 1. RT-PCR.RNA被逆转录成cDNA，随后通过PCR扩增cDNA

终点PCR 可通过凝胶里的扩增产物条带强度对RNA的表达进行定量（一种半定量方法）。例如，对起始cDNA进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点PCR得率可视化（图2），然后对条带强度进行定量，并以管家基因为参照进行标准化，预估扩增靶点的相对表达水平^[1,2]。如今，终点PCR已基本被实时PCR 或qPCR 取代了，因为它们可获得更可靠和更准确的基因表达定量结果。

图 2：起始cDNA连续稀释液的PCR得率，通过在琼脂糖凝胶上对PCR产物染色进行可视化观察。

PCR可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列差异。例如，基因敲除和敲入小鼠等转基因生物的基因分型^[3]。引物对经设计位于目标区域侧翼，可根据是否存在扩增子及扩增子长度来检测遗传变异（图 3）。

图 3.PCR用于转基因生物的等位基因分型。(A) 可用针对目标区域的特异性PCR引物来检测基因位点是野生型序列（深灰色）还是转基因序列（黄色）。(B) 如该凝胶照片所示，PCR产物可用于确定基因型。在这些实验中，使用了野生型 (+/+)和转基因  (+/–和–/–) 小鼠的基因组DNA。

但是如果为了检测特定核苷酸突变，则必须对扩增的序列进行进一步分析。例如， PCR扩增子测序就是研究单核苷酸变异（SNVs）和单核苷酸多态性（SNP）的方法之一。强烈推荐使用高保真DNA聚合酶，以防止在PCR过程中引入多余的突变。

通过PCR进行基因分型也是对癌症和遗传病中的 突变进行遗传分析的一个基本方式。

PCR被广泛应用于目标DNA片段的克隆，该技术被称为 PCR 克隆。在直接PCR克隆中，DNA（如，gDNA、cDNA、质粒DNA）的目标区域被扩增并插入到特殊设计的兼容载体中。

图 4.PCR克隆：通过PCR制备的插入片段被克隆到兼容载体中。(A) 直接PCR克隆技术包括TA和平端克隆。(B) 间接PCR克隆，扩增子可在插入到兼容载体之前被修饰，如进行限制性酶切。

除了制备插入片段，PCR也是一种在在克隆后筛选克隆是否携带目标插入片段的有效方法。引物经过设计，可以用于确定载体中插入片段是否存在和插入方向。

PCR克隆的一大优点是能够通过克隆将所需突变引入目的基因中，以便进行突变研究。在 定点突变中，经过设计的PCR引物可将碱基置换、删除或插入整合到特定序列中。如 图5所示，引物定位到已克隆至质粒中的序列上。随后，含有引入突变的PCR产物通过自我连接，重新生成环状质粒，并用于转化感受态细胞。

图 5.PCR用于定点突变。该方法使用非重叠引物（红色星号=突变核苷酸，灰色线条 = 删除的序列，蓝色线条 = 插入的序列）。也可考虑使用其他引物设计，如具有5′重叠序列的引物^[4-6]。

图 6.使用含突变序列和同源末端序列的PCR引物进行的定点突变。该图所示方法阐述了 Invitrogen™ GeneArt™ 定点突变试剂盒的机制，其中，方块代表重组和突变位点。

PCR可用于研究位点特异性甲基化。在 甲基化特异性PCR（MSP）方法中，设计了两个引物对，以区分目标位点的甲基化状态^[7,8]。

首先使用重亚硫酸盐处理DNA样品，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。重亚硫酸盐处理不会影响甲基化的胞嘧啶(m5C) 。为了检测甲基化位点，一对引物经设计 带有 鸟嘌呤（G），可与目标序列中的 m5C 配对；为了检测未甲基化位点，另一对引物带有腺嘌呤（A），可与重亚硫酸盐转化分子中的U配对（随后，与后续PCR循环中的胸腺嘧啶（T）配对）。通过引物配对得到的阳性PCR扩增结果可用于确定位点的甲基化状态（图 7）。

图 7.甲基化特异性PCR第一步，使用重亚硫酸盐处理DNA样品，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。设计两个引物对（甲基化和未甲基化），从而根据重亚硫酸盐处理DNA的扩增结果来区分目标位点的甲基化状态^[7,8]。

甲基化研究中所使用的DNA聚合酶除了能够扩增富含AT的序列，还必须能够读取识别重亚硫酸盐处理后DNA中的U残基。而高保真DNA聚合酶含有来自于古细菌起源的尿嘧啶结合域，所以不适用于MSP（除非经过特殊修饰）。

实时PCR 可代替终点PCR，为MSP提供更准确的甲基化定量分析。利用实时PCR，对PCR扩增子的熔解曲线分析是检测目标位点甲基化状态的一种替代性PCR方法。

PCR是为测序富集模板DNA的一种相对简单的方法。为保证DNA序列准确性，强烈建议使用高保真PCR来制备测序模板。

在 Sanger测序中，PCR扩增片段经纯化并用于测序反应。使用常用的测序引物结合位点（如M13或T7“通用引物”结合位点）对PCR引物的 5′末端进行标记，以简化测序工作流程（图 8）。

图 8.用于Sanger测序的PCR扩增子制备。使用常用测序引物位点标记PCR引物，以简化实验流程。

二代测序 （NGS）中，PCR被广泛用于构建DNA测序文库。在NGS文库制备中，DNA样品通过PCR反应富集（在起始量有限的情况下）并使用adaptor（以及用于多重检测的index）标记（图 9）。除了具有高保真度，DNA聚合酶还应具有最小的扩增偏好性，从而使测序文库具有高覆盖度。

图 9.使用PCR为新一代测序制备DNA样品。

PCR技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。这些应用要求可靠的性能、卓越的灵敏度和严格的标准。因此，所使用的PCR仪和PCR试剂必须符合这些要求和目的。

分子诊断应用包括基因检测、致癌突变检测以及感染性疾病检测。在法医学中，利用 PCR进行人类身份鉴定是通过对独特的短串联重复序列（STR）进行扩增而区分个体的。在农业学中，PCR在食物病原体检测、育种植物基因分型和 GMO测试中具有重要作用。

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参考文献：

1.Raeymaekers L (1999) General Principles of Quantitative PCR.In: Kochanowski B, Reischl U (editors), Quantitative PCR Protocols.Totowa, NJ: Humana Press. pp. 31–41.

2.Siebert PD (1999) Quantitative RT-PCR.In: Kochanowski B, Reischl U (editors), Quantitative PCR Protocols.Totowa, NJ: Humana Press. pp. 61-85.

3.Nobel Media AB (2014) The 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine - Advanced Information. nobelprize.org 

4.Zheng L, Baumann U, Reymond JL (2004) An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.Nucleic Acids Res32(14):e115.

5.Liu H, Naismith JH (2008) An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.BMC Biotechnol8:91.

6.Xia Y, Chu W, Qi Q et al.(2015) New insights into the QuikChange™ process guide the use of Phusion DNA polymerase for site-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res43(2):e12.

7.Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (1996) Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.Proc Natl Acad Sci U S A93(18):9821–9826.

8.Huang Z, Bassil CF, Murphy SK (2013) Methylation-specific PCR.Methods Mol Biol 1049:75–82.