Platinum II Taq热启动酶在高通量PCR中的应用

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当需要使用多个不同的PCR反应来快速分析大量样本时，需要克服多个挑战。每个PCR的反应条件均需要进行优化，但每个PCR反应的最优反应条件可能不一致。首先，不同的PCR反应通常需要不同的引物退火温度。其次，不同的扩增子长度可能不一致，需要的延伸时间也会不一样。所以，当使用传统PCR试剂时，不可能同时运行多个不同的PCR反应，只能依次进行，需要花费很多时间。

创新型的Platinum II Taq 热启动DNA聚合酶可解决这些难题。经改造的Taq酶可实现快速DNA合成。Platinum II PCR缓冲液的“共稳定分子”能在退火步骤增强模板引物复合物的稳定性，增强反应特异性，因而无需对每对引物的退火温度进行优化，不同的PCR反应可以使用同样的退火温度（60 ℃）和延伸时间。本研究中，我们测试了Platinum II Taq热启动DNA聚合酶在高通量PCR方面的性能。

创新性Platinum II PCR缓冲液可实现使用统一的退火温度

多反应同时扩增可极大节约时间

• Invitrogen™ Platinum™ II Hot-Start PCR Master Mix (2X) （货号14000012）或者Platinum™ II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) （货号14001012）

• 正向和反向引物

• Invitrogen™ E-Gel™ 通用琼脂糖凝胶

当准备进行PCR扩增时，推荐参考以下指南（表1、表2）：

表1. PCR反应体系配制

表2. PCR循环条件

• 一般18-30 mers，GC含量为40%-60%；

• 引物解链温度在55-65℃之间；

• 避免引物对之间的解链温度相差≥10℃；

• 避免引物自身互补，避免引物3’端互补；

• 如有可能，引物的3’端加1-2个G或C；

使用Platinum II Taq热启动DNA聚合酶，多个不同PCR反应可以同时进行

在设定一般PCR反应条件时，需要计算考虑每对引物的退火温度，通过测试或梯度PCR进行优化。并且不同的片段需要特定的延伸时间，延伸时间过长可能会引起非特异性扩增。在此我们测试了Platinum II Taq热启动DNA聚合酶当延伸时间长于15 s/kb时是否还能保持特异性扩增。

从图1结果可以看出，在同一个热循环仪中，Platinum II Taq可以特异性地扩增出不同长度的扩增子，其Platinum II PCR缓冲液中的‘’共稳定分子”可实现使用统一退火温度及灵活的延伸时间。

图1. Platinum II Taq热启动DNA聚合酶可实现长短扩增子的同时扩增。使用Platinum II Taq热启动DNA聚合酶和其他供应商热启动DNA聚合酶从50 ng人类基因组DNA中同时扩增132 bp, 251 bp, 1005 bp和3.9 kb的片段。(A) NEB OneTaq™ Hot Start DNA Polymerase, (B) Qiagen Fast Cycling PCR Kit, (C) Roche FastStart™ Taq DNA Polymerase.

快速的扩增方案，大大缩短循环时间

常规Taq 酶的扩增速度为60 s/kb，所以单个PCR反应需要长达一个多小时。Platinum II Taq热启动DNA聚合酶经改造优化，扩增速度为15 s/kb。从图2结果来看，使用Platinum II Taq，一次完整的PCR反应时间为36 min，而其他聚合酶需要1小时以上，且扩增速度的加快并不会影响反应的特异性。

图2. 快速合成速度可减少PCR运行时间。使用不同品牌DNA聚合酶从50 ng人类基因组DNA中扩增529 bp的片段。(A) Sigma-Aldrich KAPA2G™ Fast HotStart PCR Kit, (B) NEB OneTaq Hot Start DNA Polymerase, (C) Promega GoTaq™ G2 DNA Polymerase, (D) Toyobo Quick Taq™ HS DyeMix, (E) Roche FastStart Taq DNA Polymerase, and (F) Sigma-Aldrich JumpStart™ Taq DNA Polymerase.

高通量PCR反应所需的反应稳定性

Platinum II Taq热启动DNA聚合酶所使用的抗体热启动技术可抑制室温下DNA聚合酶的活性。在此我们测试了室温下配制好反应体系后，即刻进行PCR和放置24 h后再进行PCR的结果差异。从图3结果可看出，室温放置24 h后，Platinum II Taq的特异性和灵敏度没有发生变化。

图3. 室温下PCR反应的稳定性。使用Platinum II Taq热启动DNA聚合酶，分别从0, 0.016, 0.08, 0.4, 2, 10, 50, 250 ng人类基因组DNA中扩增735 bp的片段。

通过以上实验对比，可看出Platinum II Taq热启动DNA聚合酶特别适用于高通量PCR。具有不同解链温度的引物可在同一个PCR循环中扩增不同长度的扩增子，扩增速度比常规PCR酶快2倍以上，且PCR反应体系可在室温下保持稳定。总之，Platinum II Taq热启动DNA聚合酶可在同一循环中同时进行多个不同的PCR反应，提高了方便性和快速性的同时，有助于增加PCR扩增的通量。

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