Vege Res | 使用激光捕获显微切割TMT定量蛋白组学技术分析番茄减数分裂期花粉母细胞高温诱导蛋白组的变化

番茄 (Solanum lycopersicum L.) 花粉发育适宜的温度为21-24℃。当环境温度高于一定的限值时，植物的生长生殖发育会受到不良的影响，诱导高温胁迫 (Heat Stress)。花粉发育期对温度最为敏感， 高温胁迫 会导致花粉败育 和 凋亡。没有完成正常授粉受精番茄果实出现空腔 (无子)，变小，导致果实的品质和产量下降。在我们多年的研究过程中发现， 番茄根砧品种‘Maxifort’（Solanum lycopersicum L. x S. habrochaites)雄花发育表现出极其高的抗热性能。前人有关花粉 抗热的研究主要针对花粉成熟后期花粉囊开裂之后，次期可以收获大量的花粉样品。花粉发育前期，花粉母细胞被包裹在完整的花粉囊内，而完整的花粉囊壁由药室内壁，中层，和绒毡层三层细胞组成。获取均质的花粉母细胞存在很大的技术难度。

本实验使用‘Maxifort’，首先确定了含有减数分裂期花粉母细胞的花苞尺寸，然后用冰冻切片机把花苞横向切出20微米厚的样品切片，最后再用激光捕获显微切割技术（LCM）获取到正在进行减数分裂的花粉母细胞均质样品。针对LCM微量样本，我们开发了用 Barocycler压力循环技术提取蛋白的方法。使用tandem mass tag (TMT) 蛋白定量分析 方法；定量分析出6343个花粉母细胞蛋白，其中254个蛋白在高温胁迫下有显著差异。对差异蛋白的功能分类分析表明：1）高温诱导的96个蛋白主要包括热激蛋白，热应激转录因子，钙网蛋白以及胞吐作用相关的蛋白；受影响的生物功能主要涉及新合成蛋白的折叠和细胞内定向传输，变性蛋白的重新折叠以回复次级结构，和移除细胞内变性聚集及受损的蛋白；2）高温抑制的158个蛋白主要参与泛素介导的蛋白降解途径、抗氧化机制以及碳水化合物和脂质的代谢等生物学过程；3）影响减速分裂过程中染色体分离 和 程序性细胞死亡 的 关键蛋白在高温胁迫下发生了显着变化。这些高温诱导蛋白可直接参与雄性配子体早期发育阶段的耐热机制。综上所述，本研究开发了用LCM收集统一无杂质的花粉母细胞的方法，实现了对微量的LCM样品进行蛋白质组学的定量分析。本实验体系可有效用于从多细胞复杂生物组织样本中 分离单一种类的细胞 进而进行与其功能相关的蛋白质组学研究。

图1 实验过程图解

田纳西州立大学农学院周素平教授为论文的通讯作者，李卉博后论文第一作者，田纳西州立大学秦耀国，吴兴波，Joshua O’Hair，Jesse Potts，美国农业部植物、土壤和营养研究所杨咏，Tara Fish，Therodore Thannhauser也参与了该研究。该研究得到了1890 Institution Teaching, Research and Extension Capacity Building Grants (CBG) Program，Award No. 2018-38821-27737, 2014-02868 （美国农业部国家粮食和农业研究所对1890年学术机构教学科研及推广能力建设基金）和Evans-Allen Research Funds from USDA-NIFA（美国农业部国家粮食和农业研究所Evans-Allen研究基金）的赞助。