下一代生物技术产品开发、生产和控制策略：上游策略
未来生物制造必须解决行业面临的挑战，包括降低产品成本(CoG)的需求，加快市场全球化进程，缩短管线产品开发时间，降低患者供应风险，提高产品质量。在美国马里兰州盖瑟斯堡召开的题为“下一代生物技术产品开发、制造和控制策略”的CASSS化学、制造和控制(CMC)论坛上，讨论了这些机会。
先进技术包括一次性使用生物反应器、交替式切向流(ATF)系统、模块化和封闭式工艺设备、过程分析技术(PAT)以及其它分析系统。当在未来的生物制造中使用时，这样的系统应该能够实现稳健的工艺，减少浪费，提高滴度，降低不合格产品，减少所需的人员数量，并显著降低与技术转移到新地点相关的风险。
使用用于培养基成分和缓冲液混合及储存的一次性使用料液袋，以及封闭式工艺的一次性使用、预灭菌生物反应器，可消除一些在线清洗(CIP)和在线灭菌(SIP)的需要，同时降低污染风险。在不同地点创建模块化而本质相同的生产基地的能力，可降低技术转移的工作量和风险。PAT和未来的分析应该能够实现更多的实时过程控制，并减少对批次放行分析的依赖。这些创新还应推动在生产车间进行测试，并降低质量控制实验室的占地面积。分子建模、细胞克隆以及生物制药行业对柱层析等进行工艺建模的能力的进步，应能提高滴度，降低分子变异性，并加快工艺开发。然而，这些新技术的使用以及针对未来生物制造基地的先进设计的实施，将挑战现有的监管模式，因此，为了实现理想的未来生物工艺，需与监管当局建立伙伴关系。
上游策略
论坛的第一部分：“Continuous and Advances in Manufacturing: Upstream” (生产中的连续化趋势和发展：上游) 集中讨论了使用连续生产系统(如灌流培养)以及其它上游生产先进技术进行生产的重组蛋白产物的工艺。这些工艺正越来越多地被生产商所采用，并被用于不同的生物药形式。本次会议探讨了上游工艺中先进技术的使用，以及工艺控制策略的相关变化，包括生物药生产中PAT应用。演讲人提供了案例研究，并讨论了利用先进的生产和控制策略来培养和收获细胞的机会、挑战以及解决方案。
这一部分的第一个演讲是Brian Turner (Sanofi Genzyme)的“Second-Generation of Cell Culture for Therapeutics Enzymes” (治疗性酶的第二代细胞培养工艺)。该公司在生产重组酶治疗药物治疗罕见溶酶体贮积病患者方面有着悠久的历史。目前，Cerezyme (imiglucerase)、Fabrazyme (agalsidase beta)和Myozyme (alglucosidase alfa)药物底物仍在使用25年前开发的基于微载体的灌流技术平台、以大型不锈钢生物反应器进行生产。
公司已经启动了第二代工艺开发项目，以提高生物反应器的产率，简化操作，增强工艺稳健性，降低CoG，以更好地确保产品的可靠供应。具体改进的例子包括采用占地更小的一次性使用技术；使用化学限定、无动物源性成分的培养基，相比原有灌流工艺，其可使单位体积产量提高>5x；以及使用更加可靠的ATF过滤器设备进行细胞分离。Turner强调了即将到来的变化，包括一个一次性使用生产工厂的启用，相应的技术转移，以及随后的相当性确认。
（相关阅读：1. 强化灌流工艺成功放大至临床和商品化规模；2. 与补料分批“头对头”比较显示，灌流细胞培养可降低工艺和产物异质性）
Refine Technology（ 现为 Repligen）开发用于灌流培养系统的交替式切向流（ATF）技术 (https://www.repligen.com/technologies/xcell-atf)
第二个演讲是Frank V. Ritacco (Bristol-Myers Squibb)的“Next Generations Manufacturing with a Focus on Bioreactor Perfusion Technology” (聚焦于生物反应器灌流技术的下一代制造)。他探讨了N – 1灌流结合高密度接种中国仓鼠卵巢（CHO）细胞补料分批培养。这样的生产工艺已被证明可以提高单位体积产量，缩短补料分批生产的时间。将N-1灌流作为平台工艺的一部分使用，需要高通量筛选多个克隆，并优化培养基和工艺参数。
BMS开发了一种N-1灌流工艺，并开发了一系列使用摇瓶、细胞培养管以及深孔板的N-1灌流规模缩小模型。优化的N-1灌流规模缩小模型，结合Ambr15补料分批生产微型生物反应器(Sartorius Stedim)，形成了一个高通量的稳健工作流，可在平台化的N-1灌流工艺中，针对单克隆抗体（mAb）生产，进行克隆筛选实验、培养基开发以及参数优化。
（相关阅读：1. 使用N-1种子罐灌流，开发强化补料分批生产平台，获得翻倍滴度；2. 从传统工艺到强化工艺：产量提升8倍，成本降低10倍；3. 通过前期灌流和超高接种细胞密度，实现CHO强化补料分批培养；4. 用于灌流细胞培养的规模缩小模型）
第三场演讲是Gordon Magill和Brian Horvath (Genentech)的“Evaluation of Raman Spectroscopy for On-line Monitoring of Cell Culture Product Quality” (评估拉曼光谱用于细胞培养产品质量的在线监测”。Horvath讨论了行业对开发和应用拉曼光谱进行生物过程监测和控制越来更高的兴趣。虽然拉曼方法已被用于预测细胞密度和常规代谢物，但利用拉曼监测产品滴度和质量的工作还很有限。
Magill和Horvath讨论了使用拉曼光谱对多种产品和CHO细胞系的抗体滴度、电荷异构体、粒径异构体以及糖型进行了在线预测。评估的产品包括标准抗体和复杂分子形式。结果支持在生产中使用拉曼技术作为操作决策的指导。但是，要将拉曼方法转化至良好生产规范(GMP)环境还需要更多的工作，包括让监管机构熟悉该技术的此类应用。
会议的最后一场演讲是Christopher Murphy (Brammer Bio)的“Upstream Manufacturing Platforms for Viral Vectors” (病毒载体的上游生产平台)。他介绍了基因治疗和基因修饰细胞治疗通过临床开发的快速发展 - 在过去的一年里，有多个新药物获批。用于此类药品的病毒载体生产复杂，其上游工艺涉及广泛的技术和试剂。Murphy强调了这些上游平台及其可放大性，并讨论了生产病毒载体所需的关键原材料的管理。
上游策略:小组讨论
上午的会议以小组讨论结束。CMC策略论坛的与会者被邀请对最佳实践以及其它需要进一步澄清的方面进行讨论。专家组成员包括Brian Horvath、Nobuko Katagiri (FDA生物制品评价和研究中心CBER)、Christopher Murphy、Frank Ritacco、Brian Turner和Haoheng Yan (FDA药物评价和研究中心)。以下为讨论主题、问题以及回答。
灌流/ATF系统：灌流生产工艺可以提高产品的一致性和产量，也可以缩短细胞扩增阶段的时间，因为培养基持续更新，因此相比其它生产形式，可实现更加一致的细胞外环境。灌流技术可以应用于整个细胞培养过程，包括生产，而在N-1阶段进行灌流是最初开始尝试这种技术的一种更简单的方法。因为这个阶段的灌流操作不太可能影响细胞培养生产阶段表达的蛋白质的质量，因此确定相当性不像在其它阶段那样具有挑战性。相比离心或其它系统，ATF是灌流操作的首选方法。
筛选对于选择适合灌流平台的克隆尤为重要。灌流规模缩小克隆筛选模型可提供很多好处，因为筛选可发现可能在实际ATF工艺中对灌流响应不佳的细胞系。克隆的筛选不仅需要针对产量，也要确保其在灌流平台中可生产出所需的产品。例如，糖基化可能是受所选克隆影响的一个关键属性。因此，必需评估克隆是否能够在糖基化和其它CQA方面，达到产物质量目标特性(PQTP)。
ATF的剪切/筛分问题：剪切应力是ATF工艺中讨论较多的一个问题，其会导致细胞活性下降。目前还不清楚这是由受应激的细胞还是其它因素引起的。剪切应力对于可在ATF中获得最佳性能的新细胞系来说通常不是问题，但对于较老的细胞系来说可能是个问题。在规模缩小模型中，剪切可能是由细胞通气的增加所引起的。在ATF工艺中，产物筛分和聚集可能也是需要考虑的问题，但这取决于具体的产品。
在讨论中，有一个问题是关于规模缩小的ATF模型是否具有预测性。使用规模缩小模型(2.5-50 L)的经验表明，其筛分现象与大规模工艺类似。筛分在开始运行时较高，但到第30天逐渐降低(30%筛分系数)。在高细胞密度和存在细胞裂解时，由于筛分的作用，可观察到低聚糖分布的变化。
随着细胞密度的增加，会导致更多的细胞裂解，其可能导致ATF系统污染。抗凝剂的使用会有所帮助，但在细胞培养中，使用的过滤器必然会存在被污染的情况。彻底解决这一问题的唯一方法就是更换过滤器。
使用连续生产或其它新技术的优点和缺点：通常，上游工艺的连续生产涉及到灌流培养的使用。灌流工艺可以通过不同的方式进行，如在N-1阶段或在整个细胞培养过程中使用。也有公司使用混合的工艺方式。
优点：先进工艺技术可以
提高单位体积产量
降低产品成本（CoG）
简化工艺内澄清步骤 (使用ATF)
实现工艺的稳健性
提高微生物安全
缩短生产时间(限制不稳定蛋白的降解)
降低占地(可选择规模扩展，而不是规模放大)
此外，在N-1阶段使用灌流系统可以让生物药厂商保留现有的大型发酵罐。灌流在这个阶段很容易实施，因为生产阶段没有改变。
缺点/挑战：采用连续的上游工艺和其它先进技术也存在挑战。其中之一与批次定义相关的顾虑。批次是否与ATF更换或药物底物批次有关?如何进行过程性能确认(PPQ)运行?在一个持续时间较长的工艺中，偏差的界线应该怎样划定?你能估计其影响吗?总的来说，专家组和与会者认为，连续批次中偏差存在对整体运行风险的影响，取决于发生了什么偏差以及何时发现偏差。
鉴于工艺体积，灌流工艺也需要大量的培养基。另一个缺点是资产使用。生物药厂商要如何处理仍然有用的不锈钢罐呢? N-1灌流系统是解决这一问题的一种方法。
另一个挑战是如何纯化来自高产量生物反应器的大量物料和产物。下游工艺可能需要大量的开发工作，且必须前瞻性地集成到整个生产过程当中去。最后，大量一次性使用耗材的处理也会成为一个问题。
上游工艺的技术进步还会带来哪些技术或法规方面的挑战?传统或已众所周知的工艺平台可实现更快、更有效的执行，减少人员，有效地使用资产，降低偏差，并简化供应链管理。如果没有足够的知识可依赖，使用新技术就无法提供这些优势。由于监管机构也不太可能熟悉新技术，使用这些系统的生物制药商可能会面临更多的监管问题，也可能需要比未使用这些技术的制药商提交更多的数据。
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原文：A.Mire-Sluis, S.Kennett, S.Advant, et al., Next-Generation Biotechnology Product Development, Manufacturing, and Control Strategies. BioProcess International, 2020.
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