应用细胞灌流培养，降低双特异性产物聚集，单体产量提高4-5倍
来自美国Amgen公司的研究人员在2019年第304期的《Journal of Biotechnology》杂志上发表了题为“Perfusion CHO cell culture applied to lower aggregation and increase volumetric productivity for a bispecific recombinant protein”的文章。文中，研究人员先对一种会随培养时间而聚集增加的双特异性抗体（高分子量物质HMW可达62%）在补料分批和强化细胞培养工艺中的行为进行了研究。结果发现，蛋白质聚体会随生物反应器中累积的蛋白质的浓度而提高，且即使在强化工艺中，活细胞密度翻倍，蛋白质浓度达到最高值后，培养液中可溶性蛋白质也不再增加，说明额外分泌的蛋白质发生了沉淀。为克服这一限制，并维持培养中的细胞特异性产率（Qp），研究人员开发了一种灌流工艺，将重组蛋白从生物反应器中连续去除，以维持低产物浓度，并相应地降低蛋白聚集。实验研究了生物反应器中1到5倍不同的活细胞密度（VCD），在所有VCD条件下，Qp均可维持。相反，之前的强化工艺显示，在培养技术时，Qp呈现“表观的”2.5倍降低，原因可能是在更高的浓度条件下，蛋白质溶解性降低。结合更低的聚集水平以及恒定的Qp，使用优化的灌流工艺可获得可回收产物（即单体）高达4到5倍的产量提升。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文，或查看相关文章："应用连续灌流原理，提高双特异性分子产物质量和产量”。
简介
在生物制品生产时，重组蛋白经常会在哺乳动物细胞培养中发生聚集。聚集的程度取决于多种因素，包括蛋白质分子结构和稳定性、蛋白质表达、细胞内折叠和分泌以及工艺条件。一般情况下，培养中的高聚体水平是不希望出现的，因为这需要在纯化过程中，将HMW降低至低水平，会加重工艺负担，且往往会降低工艺产量。
随着蛋白质浓度的增加，重组蛋白会形成二聚体、三聚体或更高级别的结构。这在制剂开发中已经进行了较多的研究，因为提高浓度会促进蛋白质交联。相似的，细胞培养中蛋白质浓度的增加与更高的HMW水平有关。这种现象在传统的批次、补料分批或强化的细胞培养工艺中更为常见，因为在收获前的整个培养过程中，蛋白质浓度会持续增加。
此前在开发用于重组双特异性蛋白质X的细胞培养工艺时，研究人员发现，收获前蛋白质HMW可达到62%。蛋白质X从分子特性来讲，是一种"表现较差"的产物，如1）分子不同部分的低、高等电点（在溶液pH 4.9-10.1时，会导致一个带负电荷的结构域连接到一个带正电荷的结构域），2）低Tm以及3）高聚集速率。此外，公司内部的制剂研究显示，蛋白质X的溶解度有限，一种带高静电电势的分子结构可以很容易地介导蛋白质之间的相互作用，从而导致胶体不稳定性。蛋白质X在培养中也较难表达，典型的细胞特异性产率<5 pg/cell-day。在使用3种不同CHO细胞系的工艺优化过程中发现，尽管通过工艺强化（峰VCD=30-60x10^6 cells/mL），相比基础补料分批工艺（峰VCD=10-30x10^6 cells/mL），综合活细胞密度（IVCD）提高了两倍，但最终滴度并没有相应地增加，故而推断与滴度增加相关的蛋白质聚集导致了不溶性HMW物质的形成。
为了避免这种现象，研究评估了灌流细胞培养工艺。灌流以往常用于在生物反应器内长时间滞留会发生降解或活性降低的不稳定蛋白质。在此研究中，蛋白质降解或活性本身不是主要问题，研究的目的是维持生物反应器中较低的蛋白质浓度，以防止聚集。实验测试了不同的目标灌流VCD，以了解其对蛋白质浓度、产量和HMW形成的影响。总结来说，相比基础的补料分批细胞培养工艺，灌流培养可提高4-5倍的单体产量。
材料和方法
种子扩增时，使用专利的选择性培养基，在摇瓶中培养表达重组蛋白X的稳定CHO细胞系。补料分批、强化工艺以及灌流生产培养在2L生物反应器（Applikon）内进行。温度设定点和搅拌使用DCU控制。pH设定点使用CO2或Na2CO3自动控制。补液或灌流培养基使用专利的化学限定基础培养基。对于补料分批和强化工艺，产物累积在生物反应器中，直到第12天收获。
对于灌流工艺，使用过滤器，以每天1个罐体积的速率，去除耗竭的培养基，细胞截留在生物反应器内，蛋白质X透过过滤器进入滤液。使用电容探针检测生物质，以去除额外的细胞，达到4种不同的目标VCD值。每种VCD目标值维持约6天。所有工艺每日取样分析。
详细的实验操作和分析，请参考原文。
结果
灌流细胞培养可提高蛋白质X单位体积产量
为优化细胞培养条件，提高产量，研究设计了一种灌流工艺，以尽可能提高培养过程中可溶性蛋白质X的产量，并维持更低的蛋白质浓度。作为原理验证，实验测试了4种VCD连续增加的灌流条件（PER1– PER4）。结果显示，灌流中VCD增加5倍，平均单体含量可从44%提高到70%。相比强化工艺第12天收获，所有4种条件可呈现出高3到5倍的Qp。Qp的维持说明蛋白质X在所有测试的灌流条件中保持可溶。基于之前的表征研究，推测通过VCD的调节而实现对单体的调节，是HMW和产物浓度相互依赖的结果。但实验也观察到，在灌流模式中，LMW物质随VCD增加而增加。此前的稀释实验显示，LMW物质会随孵育时间而增加，推测这种趋势与收获的细胞培养液中某一成分介导的细胞外蛋白质裁剪有关，且取决于该成分的浓度，而在灌流培养中，该成分浓度与目标VCD成正比。相比传统补料分批工艺，灌流培养也可缩短分泌蛋白在反应器内的滞留时间，这可降低在生理温度条件下，由于分子间交联而导致的HMW物质，不过本研究中，蛋白质X的聚集没有随延长的滞留时间而加剧，因为如此前在36℃孵育研究中所获得的结果，HMW水平不增加，而且工艺PER1到PER4有相同的灌流速率和滞留时间，说明这不是这些工艺中影响不同HMW水平的因素，所以，结果表明，PER1-PER4中聚体水平的降低是蛋白质浓度的结果，而不是滞留时间。
使用细胞系1和4种不同VCD设定点的灌流工艺的A）VCD、B）滴度、C）单体、D）HMW、E）LMW。其中⬛)为生物反应器内上清液样品，⬜)为滤液样品。疏虚线和密虚线分别代表补料分批和强化工艺中的相应值。实线代表4种灌流工艺的平均值。所有4种灌流工艺均显示出相比补料分批和强化工艺更低的产物浓度，可接受的Qp以及更高的单体含量(N.Gomez, et al., 2019)。
总结来说，灌流培养可防止蛋白质X在生物反应器内形成聚集，同时获得恒定的Qp。目标VCD是该工艺的一个重要参数，更高的总VCD可提高滴度，但也可增加HMW和LMW水平。对灌流条件的进一步分析显示，具有最高VCD的工艺PER4仍是使每日单体产量（0.16标准化单体质量/天）和总单体质量（3.42标准化质量单位/月）最大化的最佳条件，尽管其有更高的HMW和LMW，但相比补料分批或强化工艺（0.03-0.04标准化单体质量/天）提高了4-5倍。尽管工艺PER1和PER2具有最高的单体百分比60-70%，但整体的最高单体质量稍低。分析也显示，对于补料分批和强化工艺，10天工艺好于12天工艺，因为在生产的最后2天，滴度增加有限且会产生更高的HMW。但即使与单体质量为0.94标准化单位/月的10天强化工艺比较，灌流工艺仍可在相同的时间内，生产达3.42标准化单位。
理论上，最好的工艺是将工艺PER4更高的细胞密度与工艺PER1最低的浓度结合起来。为此，需要更高的灌流速率，以进一步将蛋白质X的浓度从0.41 标准化单位/天（工艺PER4）稀释到0.06标准化单位/天（工艺PER1），单体水平最大化到70%。但该最佳工艺要求将灌流速率提高到每天7个反应器体积，目标VCD为8.0个标准化单位。更高的灌流速率有益于通过降低浓度，降低HMW物质，并通过稀释可介导蛋白质裁剪的成分而降低LMW物质。优化的工艺可使每日单体产量工艺从PER4的0.16标准化单体质量/天进一步提高到0.3标准化单体质量/天，相比补料分批或强化工艺提高10倍。采用该工艺会增加灌流培养基消耗，但是理论上可以使用更加精简的培养基配方，以降低成本。该工艺也会增加下游纯化需要处理的HCCF体积，所以可采用连续或半连续捕获技术，以避免大体积储罐的使用。
所有工艺中，重组蛋白单体的单位体积产量(N.Gomez, et al., 2019)。
更多详细结果及分析，请参考原文。
总结
实验研究了一种溶解性受限的双特异性蛋白质X，其在细胞培养过程中，HMW随蛋白质浓度增加而增加，可达62%。实验结果显示，在强化的细胞培养中，滴度平台化以及表观的Qp降低，可能是由于在更高的蛋白质浓度条件下，可溶性HMW形成所导致的。为克服该限制，研究开发了一种灌流工艺，以维持低产物浓度，并防止蛋白质沉淀。结果显示，灌流模式中VCD增加5倍，可将单体平均含量从44%调节至70%。此外，灌流可将每日单体产量增加至0.16标准化单体质量/天，与传统补料分批工艺（0.03标准化单体质量/天）相比，可提高4-5倍。另一种优化是通过提高灌流速率，理论上可达到0.3标准化单体质量/天。更高的单位体积产量得益于在低蛋白质X浓度条件下，这种“表现较差”的重组蛋白得以维持的Qp以及增加的单体含量。
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：N.Gomez, H.Barkhordarian, J.Lull, et al., Perfusion CHO cell culture applied to lower aggregation and increase volumetric productivity for a bispecific recombinant protein. Journal of Biotechnology, 2019, 304: 70-77.
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