MabSelect SuRe™ Protein A 定量：为什么匹配的标准品至关重要

Original 瑞普利金 Repligen瑞普利金 2022-12-21

简介

固定化Protein A填料广泛用于单克隆抗体和融合蛋白的纯化，其可使来自复杂起始料液的产物达到90%以上的纯度。Protein A层析的成功推广应用，已致使市面上出现了多种使用不同Protein A异构体生产的该类型亲和填料。常见亲和填料使用几种主要的Protein A异构体，包括：重组Protein A（Repligen）、MabSelect™配基（GE Healthcare）、天然Protein A（Millipore）和MabSelect SuRe™配基（GE Healthcare）。

Repligen提供三种用于残留Protein A定量的ELISA试剂盒。MabSelect SuRe™ Protein A ELISA试剂盒（产品编号：9333-1）专门用于MabSelect SuRe™配基的检测，NGL-Impact™-A ELISA试剂盒（产品编号：9222-1）专门用于Praesto Jetted A50配基的检测，而重组Protein A ELISA试剂盒（产品编号：9000-1）推荐用于所有其它Protein A异构体。本技术笔记将介绍准确定量脱落的MabSelect SuRe™配基，为什么需要使用含有匹配配基标准品的独特ELISA试剂盒。

Protein A 异构体

天然Protein A表达在金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）表面，由5个免疫球蛋白结合结构域（以E、D、A、B和C表示）、1个尾部结构域（以X表示）和一个跨膜结构域组成。其它异构体通过重组以E.Coli表达。4种异构体中的3个含有所有5个结合结构域，而MabSelect SuRe™配基是一个四聚体，由经修饰后的结构域组成，以Z表示。表1所示为不同异构体的结构域结构和分子量。MabSelect SuRe™配基和其它异构体之间较大的分子量差别是检测需要匹配标准品的原因。

表1. Protein A特性

方法

Protein A异构体来自其各自供应商。溶液以水制备成1.0mg/mL浓度，使用前冻存。ELISA实验按ELISA试剂盒说明进行。每个Protein A异构体分析浓度0.05-1.6ng/mL，在三个重复孔中，进行三次分析。每次分析在同一块ELISA板上分析所有4种异构体。

数据分析

标准曲线绘制为吸光度vs.浓度，单位ng/mL或pM。分析需转换成pM值，以计入Protein A异构体的分子量差别。对照重组Protein A标准曲线，计算每种异构体的回收率（即准确率）。回收率定义为计算浓度除以标称浓度，表示为百分率。回收率100%即说明对检测的Protein A进行了准确的定量。对高、中和低浓度进行了评估，分别为1.6、0.4和0.1ng/mL。同时使用以摩尔为单位的浓度计算了回收率，即按每种Protein A异构体的分子量将其浓度从ng/mL转换成pM。

结果和讨论

ELISA结果通常绘制为吸光度 vs. 浓度图。图1A是三次分析中一次的代表性Protein A（ng/mL）vs. 吸光度图。当浓度以ng/mL为单位进行绘图时，4种异构体有相似的响应。但是，MabSelect SuRe™配基的分子量低了大概2倍，所以以摩尔浓度进行绘图的准确性更高。图1B是相同的数据以Protein A（pM）vs. 吸光度进行绘图的结果。

图1. 吸光度响应 vs. Protein A异构体浓度

使用不匹配的标准品导致的不准确性可进一步用计算的回收率来解释。使用重组Protein A作为标准品，计算了不同异构体高、中、低浓度的回收率。表2所示为每种异构体以ng/mL浓度计算的回收率，表3所示为浓度以pM为单位计算的回收率。

每个值为三个独立分析的平均值。

表2. 使用ng/mL浓度计算的Protein A异构体的回收率（%）

表3. 使用pM浓度计算的Protein A异构体的回收率（%）

如果使用不匹配的标准品，如重组Protein A，使用ELISA进行MabSelect SuRe™配基的定量，计算浓度看起来是准确的，如表2中最右列所示。但是，基于重量的比较只有当被比较的两种物质的分子量相同时才是正确的。表3中以摩尔为单位的计算回收率显示，计算浓度不准确，而且事实上，大大低估了所存在的MabSelect SuRe™配基含量。FDA要求对残留Protein A进行定量，是因其可能会造成患者安全风险。所以，低估样品中存在的Protein A含量，会提高风险。

总结

Protein A层析的成功应用，促使行业创造了多种Protein A异构体。尽管其都具有结合免疫球蛋白的功能，但各自也是具有不同特性的独特分子。由于MabSelect SuRe™配基的分子量较低，如果使用不匹配的标准品，并以ng/mL为单位报告检测结果，会导致浓度的低报。

为准确定量脱落的MabSelect SuRe™配基，Repligen提供唯一使用匹配对照标准品的商品化MabSelect SuRe™配基ELISA试剂盒，可进行最准确、精确且灵敏的检测。

MabSelect和MabSelect SuRe为GE Healthcare注册商标。

Praesto为Purolite Life Science注册商标。